Wenn man so in der Gegen herum forscht, dann kommt man manchmal auch zu einem Ergebnis. Das ist mir jetzt auch passiert, endlich ist ein wissenschaftlicher Artikel veröffentlicht worden, in dessen Autorenliste ich an erster Stelle stehen darf.

Im Rahmen meiner Doktorarbeit arbeite ich an einem Hochauflösungsmikroskop, einem dSTORM, was kurz für direct STochastic Optical Reconstruction Microscope ist. Zusammen mit meinem Boss Jan Schmoranzer und Georgi Tadeus haben wir uns eine Methode überlegt, mit der man zwei oder mehr Farben in einem Hochauflösungsmikroskop realisieren kann, und ganz nebenbei auch noch ein paar Fehlerquellen bei der Bilddarstellung umgehen kann. Es geht dabei um Fluoreszenzmikroskopie, über die ich hier schon geschrieben habe. Die Dinge in der Zelle, die man sich anschauen will, markiert man dabei mit Farbstoffen, am liebsten mit zwei oder mehr Verschiedenen, um etwas über das Verhältnis zwischen den markierten Strukturen lernen zu können. Leider sind Fluoreszenzmikroskope nicht in der Lage beliebig stark zu vergrößern, man stößt an ein Limit, die Beugungsgrenze. Alles was kleiner als diese Grenze ist kann man mit einem normalen Fluoreszenzmikroskop nicht mehr sehen. Darüber habe ich schon im Artikel über Ernst Abbe berichtet, der genau auf diesem Gebiet geforscht hat.

Hochauflösung?

Es gibt aber Möglichkeiten um die Beugungsgrenze zu umgehen, und ich schreibe “umgehen”, weil das nie ohne Einschränkungen geht. Wenn man eine höhere Auflösung erreichen will, dann muss man an einer anderen Stelle immer deutliche Abstriche machen. Es gibt dazu mehrere Ansätze, zum Beispiel die strukturierte Beleuchtung (SIM: structured illumination microscopy), STED (stimulated emission depletion) oder photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM: photoactivated localization microscopy). Für PALM und STED gab es 2014 den Nobelpreis in Chemie.

Die Technik PALM gehört zu einer größeren Gruppe von Methoden die Beugungsgrenze zu umgehen, nämlich zur Einzelmolekül Lokalisationsmikroskopie (SMLM: single molecule localization microscopy). Zu dieser Gruppe gehören auch STORM und dSTORM. Die grundsätzliche Idee dahinter ist, dass man die Farbstoffe blinken lässt, und zwar so, dass man immer nur Signale von einzelnen Farbstoff-Molekülen bekommt ohne das sich diese überlappen. Davon macht man dann viele, sehr viele Bilder, einige tausend oder sogar einige zehntausend. Diese Bilder werden dann mit mit einer bestimmten Software untersucht, die an jedes Signal eine Funktion versucht anzupassen, und so den genauen Ort des Moleküls zurückrechnet. Mit diesem Haufen an Positionen kann man dann, wie im Pointillitismus, ein Bild aus vielen Punkten aufbauen oder rekonstruieren. Diese Methode hat Ricardo Henriques, Autor der freien Software QuickPALM, in einem kurzen Video schön illustriert (unten). Die Art der Bildrekonstruktion haben die Techniken PALM, STORM und dSTORM gemeinsam – sie unterscheiden sich in der Art und Weise wie man die Farbstoffe dazu bringt so vereinzelt zu blinken.

Was ist SD-dSTORM?

Bei dSTORM bringt man die Farbstoffe auf chemischem Weg zum blinken. Eine sauerstofffreie, reduzierende Lösung wird benutzt, um die Zustände der Farbstoffe so zu beeinflussen, dass ein Großteil einfach nicht fluoresziert und nur einige wenige leuchten. Das funktioniert nur mit organischen Farbstoffen, die die schöne Eigenschaft besitzen in dieser Lösung nach kurzem leuchten wieder in den dunklen Zustand zurück zu kehren. Dann haben andere Farbstoffe die Chance zufällig (stochastisch, siehe Name) in den fluoreszierenden AN-Zustand zu kommen und auch ein bisschen Signal bei zu tragen.

Wir haben jetzt noch ein SD vor das dSTORM gesetzt, was kurz ist für Spectral Demixing. Das ist unser Ansatz um diese Technik mit mehreren Farben machen zu können. Benutzt man nämlich einfach rote und grüne Farbstoffe funktioniert das zwar auch, man handelt sich aber einen Fehler in der Position der Lokalisationen der beiden Farben ein. Grün und rot liegen einige hundert Nanometer in der Wellenlänge auseinander und die Brechung in den verwendeten Linsen ist Wellenlängenabhängig. Das kennt man ja von einem Prisma. Zwar sind moderne Optiken in Mikroskopen meistens achromatisch, also so weit korrigiert, dass das nichts mehr ausmachen sollte, aber in der Hochauflösungsmikrokopie, wo es um eine Genauigkeit von hundertstel Mikrometer geht, hilft einem so eine Korrektur nur bedingt. Im Fall von dSTORM kann man Positionen von einzelnen Farbstoffen bis auf 20 Nanometer genau lokalisieren und der Fehler durch den Wellenlängenunterschied (chromatische Abberation) hat auch mit korrigierten Optiken noch knapp 100 Nanometer. Es gibt schon Strategien wie man das am Computer nachträglich korrigieren kann, aber solche Programme lassen den Fehler lediglich auf 15 bis 20 Nanometer schrumpfen aber eben nie ganz verschwinden.