Os efeitos benéficos à saúde do consumo de uvas e vinhos têm sido atribuídos às propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antibactericidas e preventivas de doenças cardiovasculares dos seus compostos fenólicos. Entretanto, alguns microrganismos presentes nas uvas, além de afetarem a saúde das videiras e provocarem sua deterioração, podem produzir compostos tóxicos à saúde humana, denominados micotoxinas. Dentre elas, a ocratoxina A (OTA) é a principal micotoxina que pode estar presente em uvas e vinhos. A OTA é produzida principalmente pelos fungos das espécies Aspergillus niger e Aspergillus carbonarius.

A contaminação das uvas por estas espécies pode ocorrer desde o início da maturação das uvas e intensifica-se próximo à colheita, devido ao aumento da umidade relativa, da temperatura do vinhedo e em decorrência de alterações físico-químicas, como amaciamento da baga, acúmulo de açúcares e redução da acidez. É possível que além da produção da OTA (micotoxina mãe) ocorra também a formação de micotoxinas modificadas ainda no vinhedo, resultantes do próprio mecanismo de defesa da planta..

Na literatura não são encontrados estudos que relacionam a produção de OTA e micotoxinas modificadas por espécies fúngicas comumente encontradas nas uvas. Além disso, pouco se conhece sobre a influência do ponto de maturação e da variedade das uvas na formação de micotoxinas modificadas. Constatam-se também limitações no que concerne à degradação da OTA e a formação de micotoxinas modificadas ao longo da vinificação. Essa quantificação é importante porque é possível que, após suas ingestões, enzimas e componentes da microbiota de seres humanos possam atuar sobre as micotoxinas modificadas liberando a OTA e aumentando a exposição do indivíduo a este composto tóxico. Entretanto, faltam estudos nesta área para comprovar tal reconversão. Além disto, fazem-se necessários estudos de toxicidade destas micotoxinas modificadas para avaliar seus riscos potenciais à saúde.

A importância deste conhecimento ressalta quando se sabe que a OTA, por ser um metabólito estável, não é degrada ao longo do processo de vinificação, chegando ao produto final, vinhos e sucos. Ao ser ingerida ela pode acumular-se no sistema circulatório, no fígado, nos rins e em tecidos adiposos e musculares e provocar efeitos imunossupressores, teratogênicos, neurotóxicos, genotóxicos, mutagênicos e carcinogênicos ao longo do tempo.

Em vista disso, é muito importante caracterizar em quais condições os fungos que contaminam as uvas produzem as formas modificadas de OTA. Também é vital quantificar estas formas modificadas, pois a partir destes dados podem derivar estudos de avaliação de exposição e o estabelecimento de controles ao longo do processo. Estes dados e conhecimentos têm potencial para impactar diretamente os controles de processamento de suco de uva e vinho, assim como de ações regulatórias, em nível de legislação. Estas demandas determinaram o projeto encabeçado pela engenheira de alimentos Luísa Freire que, orientada pelo professor Anderson S. Sant’Ana, do Departamento de Ciência de Alimentos, da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) da Unicamp, e coorientada pelo professor Rodrigo Ramos Catharino, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF) da Unicamp, se propôs a estudar a variabilidade de formação, estabilidade ao longo dos processamentos e efeitos à saúde de micotoxinas modificadas em uvas e vinhos.

A pesquisadora Luísa Freire, autora da tese: resultados podem fornecer subsídios para melhorias nas legislações

Para tanto, os pesquisadores delinearam o projeto com base em três objetivos: 1) determinar a variabilidade de multiplicação de Aspergillus carbonarius e de Aspergilllus niger e a produção de OTA e ocratoxinas modificadas por estes fungos; 2) determinar a variabilidade de formação e degradação de OTA e ocratoxinas modificadas da colheita ao produto final, no caso o vinho; e 3) avaliar a ação do metabolismo dos ratos sobre micotoxinas modificadas. Para a engenheira de alimentos Luísa Freire, os resultados decorrentes do projeto em andamento - que já renderam publicações em dois periódicos de alto impacto, a Scientific Reports e o Journal of Agricultural Food Chemistry -, possuem potencial para fornecer subsídios significativos para melhorias nas legislações sobre a ocorrência de fungos e micotoxinas em alimentos e proteger a saúde pública.

Os dois artigos examinam a possibilidade de formação de micotoxinas modificadas e ainda não detectáveis pelos fungos e pelo mecanismo de defesa das uvas. Além disso, no artigo de revisão “Modified mycotoxins: An updated review on their formation, detection, occurrence, and toxic effects”, publicado na revista Food and Chemical Toxicology, os autores detalham os aspectos de detecção, ocorrência e efeitos tóxicos das micotoxinas modificadas que se conhecem até o momento.

Para Luísa, “é de fundamental importância que as avaliações de riscos, cujo objetivo final é proteger a saúde pública evitando o consumo de sucos de uva e vinhos contaminados com OTA, abranjam um maior número de espécies de fungos, diferentes variedades de uva e possibilite determinar a presença de diferentes formas de micotoxinas, com vistas a auxiliar a adoção de boas práticas agrícolas e de produção a fim de minimizar os riscos de contaminação e produção de micotoxinas, especialmente nos estádios finais de maturação, garantindo assim a segurança e a qualidade das uvas e de seus derivados”.



Critérios

O trabalho começa na uva e se desenvolve até o produto final, o vinho, pois desde o campo pode ocorrer a contaminação da uva pelos fungos. A partir dessa contaminação por fungos produtores de micotoxinas, a ocratoxina A pode ser produzida e não é mais passível de eliminação ao longo do processo. Nas etapas de separação da casca, fermentação e filtração do vinho observa-se uma redução da micotoxina, mas uma expressiva quantidade da OTA permanece no produto final, já que estas moléculas são extremamente resistentes a processos físicos e químicos.

Uma grande limitação atual no que concerne ao controle de qualidade e segurança das micotoxinas é a de que a legislação menciona apenas o controle da OTA e ainda não considera as formas modificadas das micotoxinas. Isto se deve, em parte, à falta de conhecimento sobre as reais condições de formação destes compostos, que dependem do alimento e do seu processamento, e quais os seus efeitos toxicológicos potenciais. A exemplo da União Europeia, a Anvisa estabelece o limite máximo de duas microgramas de ocratoxina A por quilo no vinho. No entanto, os métodos convencionais para determiná-la não se prestam à detecção das formas modificadas de OTA, que então passam despercebidas. Assim, é importante determinar se estas formas modificadas estão presentes porque, como já se disse, nos processos metabólicos do organismo é possível que ocorra a liberação novamente da toxina mãe.

Além do que, ao longo do processamento dos vinhos, tal reconversão também pode ocorrer devido à ação de leveduras utilizadas na etapa de fermentação. Em vista disso, a OTA estará sendo subnotificada e, com sua reconversão, o consumidor poderá absorver mais OTA do que o tolerável. Além disso, outra grande implicação reside no fato de algumas formas modificadas poderem apresentar efeitos toxicológicos similares ou superiores da micotoxina mãe. De fato, estes efeitos deletérios superiores já foram demonstrados para outra micotoxina.

Até o momento, o trabalho desenvolvido pela pesquisadora evidencia que a OTA pode ser modificada em duas situações distintas. A primeira, na planta em decorrência do desencadeamento do seu mecanismo de defesa ou por ação do próprio fungo. A segunda, em decorrência de processos fermentativos. “Esses processos já são estudados para as micotoxinas em geral, mas no que se sabe, somos o primeiro grupo que tem como foco especificamente o vinho em relação à formação de micotoxinas modificadas”, esclarece a pesquisadora.



Etapas

Em decorrência do roteiro estabelecido, a pesquisadora trabalhou inicialmente em meio de cultura à base de uva com fungos produtores de ocratoxina A, com vistas a verificar se a partir dela se formavam compostos modificados. E efetivamente detectou-se, além da ocratoxina A, a presença de uma micotoxina derivada, a Etilamida-Ocratoxina A. Ela propôs então uma rota metabólica que explicaria a possível ação do fungo na transformação da ocratoxina A na nova substância.

A formação de micotoxina modificada leva à subnotificação dos níveis totais de micotoxinas presentes, já que estas não são detectadas pelos métodos tradicionais. A autora alerta: “A detecção de micotoxinas modificadas constitui um desafio já que estes compostos podem contribuir para a toxidade global associada ao alimento e tem sido negligenciada pelas legislações. Em decorrência, estimativas de risco imprecisas poderão levar a medidas de gestão de risco não efetivas para proteção da saúde pública. Daí nosso objetivo de determinar a variabilidade de multiplicação e produção de OTA em uvas viníferas e investigar a formação de micotoxinas modificadas.” Deste trabalho resultou o artigo “A quantitative study on growth variability and production of ochratoxin A and its derivatives by A. carbonarius and A. niger in grape-based medium”, publicado na Scientific Reports.

A segunda etapa do trabalho teve como objetivo avaliar a influência do estágio de maturação de diferentes variedades de uvas na formação de OTA e micotoxinas modificadas. Além da OTA foram detectados dois derivados da ocratoxina A, a 14-decarboxi-ocratoxina A e a Etilamida-Ocratoxina A. Esta última micotoxina já havia sido identificada na primeira fase do trabalho, podendo ter sido produzida em decorrência do sistema de defesa do fruto ou por ação do próprio fungo. A metodologia utilizada e os resultados alcançados deram origem ao artigo “Influence of maturation stages in different varieties of wine grapes (Vitis vinífera) on the production of Ochratoxin A and its modified forms by Aspergillus carbonarius and Aspergillus niger”, publicado no Journal of Agricultural and Food Chemistry.

Na terceira fase do projeto, em andamento, está sendo realizada a vinificação com vistas a investigar no vinho a presença da OTA e suas possíveis formas modificadas. Para tanto, estão sendo desenvolvidos paralelamente métodos específicos de análises qualitativas e quantitativas. No estágio atual do estudo, é possível apenas identificar os compostos modificados, mas não quantifica-los. Na sequência os vinhos produzidos serão administrados a ratos para que se possa entender como e se estas micotoxinas são modificadas pelo metabolismo animal.



Os artigos

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691517306889

https://www.nature.com/articles/s41598-018-32907-z#Bib1

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.8b02251