Dossier d’Irène dans l’épisode 159.

Une histoire de la microscopie

Cette histoire fait partie de celles qui n’ont évidemment pas de fin, mais aussi pas de commencement, parce qu’il n’y a pas eu un jour un nouvel instrument mis au point et appelé microscope. Les systèmes optiques développés par la nature, dont nos yeux, ne sont pas parfaits, et ils vieillissent mal. On peut aisément imaginer que certains de nos ancêtres des cavernes avaient déjà du mal à voir les dessins de leurs artistes sur les murs des grottes, et très tôt le besoin de mieux voir a conduit les hommes à trouver des palliatifs, c’est à dire des lentilles de correction, et c’est par là que débute l’histoire des microscopes optiques.

Nous allons très simplement suivre un ordre chronologique pour décrire l’histoire des microscopes, parce qu’il y a en gros trois périodes, qui commencent chacune avec la naissance d’un type de microscopie, sans qu’aucun n’ait jamais ensuite disparu.

Et puis juste avant de vraiment démarrer impossible de ne pas rappeler que : micron = petit + skopein= observer (grec)

I- La microscopie optique.

Le principe repose sur l’utilisation des lentilles qui sont des objets, en verre le plus souvent, qui dévient la lumière (plus ou moins selon la couleur de la lumière) et qui, tels la loupe, permettent de former une image agrandie d’un objet que l’on ne pourrait pas voir à l’œil nu (figures 1 et 2).

Grosso modo, la meilleure résolution est d’environ 200 nanomètres (nm), ie. que l’on peut voir deux points séparés par 200nm. Un nanomètre, c’est un milliardième de mètre. Un millième de micron. Rappelons que la taille d’un atome est d’environ 0,1 nm, et un cheveu fait environ 60 microns de diamètre. Donc 200 nm c’est 300 fois plus petit qu’un cheveu environ.

Voyons plutôt comment la microscopie optique s’est développée au fil des siècles.

Histoire des sciences optiques.

Le microscope optique est le plus connu, le plus ancien, des microscopes, qui utilise deux composants bien familiers pour la plupart d’entre nous :

a) les lentilles, qui permettent, en autre, de grossir des objets que l’on ne peut pas voir à l’œil nu. Ceci en déviant les rayons de lumière.

b) la lumière, ce rayonnement de particules dont l’exemple le plus connu est bien sûr le soleil qui nous envoie tous les jours son lot de rayons. Ces particules sont appelées des photons. Chaque photon transporte de l’énergie, et selon la couleur de la lumière, la quantité d’énergie est différente. Et selon la couleur, le rayon de lumière va être dévié différemment par la lentille. Rappelez vous, pour les plus vieux d’entre nous, cette pochette d’album de Pink Floyd « The Dark side of the Moon », avec un rai de lumière à gauche venant frapper un prisme (figure 3).

À la sortie du prisme, à droite, le rai de lumière est joliment décomposé en un arc en ciel. C’est parce que 1- la lumière blanche est composée par un ensemble de rayons de toutes les couleurs. 2- les rayons de couleurs différentes ne sont pas déviés avec le même angle.

Le principe de la lentille, c’est de dévier les trajets optiques venant des objets que vous voulez regarder. Par exemple, dans le cas d’une loupe toute simple, les rayons lumineux émis par votre objet sont déviés par la loupe et en quelque sorte bluffent nos yeux en leur faisant croire que cet objet est plus grand que ce qu’il n’est en réalité (figure 2). En associant plusieurs lentilles, le trajet optique se complique, mais permet de former des images à des positions bien déterminées et avec une taille bien précise. C’est le microscope optique tel que nous le connaissons de nos jours (figure 4).

Un des plus gros problèmes est que, comme nous l’avons dit plus haut, les rayons lumineux ne sont pas déviés avec le même angle en fonction de leur couleur. Il en résulte une distorsion des images, que l’on appelle l’aberration chromatique, qui est un problème majeur de la technique, mais l’on reviendra un petit peu là-dessus.

Pour revenir à l’historique, en 1850, une lentille a été découverte à Nimrud (sur le site de Ninive), en Irak, par l’archéologue Austen Layard (qui était français malgré ce nom bien anglais!) Elle semble être âgée de 3000 ans environ (elle aurait été fabriquée entre le Ier millénaire av. J.-C. et le VIIe siècle av. J.-C.) et est exposée au British Museum de Londres. Il s’agit d’un disque en Crystal de roche, qui pouvait peut-être servir de loupe, mais son polissage était très grossier, et au final, on ne sait pas trop bien de quoi il s’agit !

Il y a ensuite d’autres vestiges, telle cette lentille datant à peu près du Ve siècle avant JC, qui fut découverte en Crète, dans une grotte dans le mont Ida. Elle semble être de meilleure qualité que celle de Nimrud.

Les auteurs romains Pline et Sénèque mentionnent dans leurs écrits un graveur à Pompéi qui utilisait une lentille. On peut trouver aussi des écrits romains mentionnant des moyens grossissants tels que des boules de verre remplies d’eau ou bien des émeraudes taillées en lentille concave.

Toutefois, on peut dire que l’histoire des sciences optiques en tant que telles commence probablement à Alexandrie, vers 300 ans avant JC. À cette époque, la ville était grecque et les sciences devenaient de plus en plus importantes en Grèce, notamment la géométrie. Un des grands noms de la géométrie était le fameux Euclide. Il est peut-être à l’origine de pratiquement tout ce que nous pouvons apprendre en géométrie à l’école, mais c’est aussi lui qui a découvert que la lumière voyage en ligne droite. Les premières lois de la réflexion de la lumière sur une surface émanent de lui. Vers 1100, le savant arabe Alhazen Ben Alhazen mentionne le pouvoir grossissant des lentilles, sans qu’en soit tiré apparemment des conséquences sur l’usage pouvant en être fait.

Au XIIIe siècle, Roger Bacon a utilisé, et cette fois-ci on le sait de façon plus documentée, des lentilles de verre en tant que loupe.

Bacon développait cette nouvelle technique pour aider les gens qui avaient des problèmes pour lire. Roger Bacon, était un moine franciscain anglais, qui s’est inspiré apparemment des travaux d’Alhacen. Il appellait son invention « reading stone » que l’on peut traduire par « pierre de lecture » ou « pierre pour lire » en mauvais français ! Ces lentilles étaient souvent utilisées par les moines, notamment pour enluminer leurs manuscrits. Elles étaient au début très simples, avec un bord plat et l’autre convexe, c’est à dire une simple sphère coupée en deux. Avec le temps, les moines ont expérimenté et leur instrument s’est perfectionné, en particulier en jouant avec la courbure. En effet, moins la courbure est prononcée, plus la lentille agrandit les objets.

Il faut attendre jusqu’au XVIe siècle pour voir poindre la première application scientifique concrète des lentilles. Jusqu’à cette période, Il s’agissait de verres correcteurs pour nos yeux déficients.

Vers 1590, le hollandais Zacharias Janssen profite de ses compétences de fabriquant de lentilles pour inventer un nouvel outil : le microscope optique. Il est alors formé par deux lentilles convexes, dans un ensemble de tubes coulissants. Mais bon, honnêtement, personne n’est certain de cette paternité ! Janssen est né à La Hague (probablement !), et c’est son père qui avait une entreprise de fabrication de lentilles, qui l’employait. Zacharias aurait découvert les vertus de l’association de ces lentilles alors qu’il n’était encore qu’adolescent et aurait montré sa découverte à un diplomate ami de la famille. Mais en réalité il n’existe pas d’exemplaire certain de son microscope. Peut-être un dans un musée hollandais, pas sûr. Il avait un grossissement de 10X, donc pas particulièrement performant et c’est peut-être pour cela que notre homme s’est apparemment reconverti dans le trafic de fausse monnaie !

Au XVIIe, les recherches scientifiques convergent vers le développement de la microscopie. Encore une fois, personne ne peut prétendre à la paternité de cette invention. Plusieurs modèles de microscopes sont apparus à la même période.

Toutefois, le plus célèbre est sans conteste celui d’Antoni Leewenhoek, que l’on considère comme le père de la bactériologie en tant que science, et qui est un personnage lui aussi bien intéressant!

Antoni Van LEEUWENHOEK (1632-1723) (Figure 5)

Leeuwenhoek est né à Delft aux Pays Bas, le 24 octobre 1632.

À 16 ans, il est envoyé à Amsterdam en tant qu’apprenti chez un drapier. L’histoire raconte qu’il se débrouilla fort bien, qu’il monta son entreprise qui fut florissante.

C’est vers 1668, 20 ans plus tard donc qu’il présente son premier microscope. Alors comment ce commerçant dans les tissus en est-il arrivé à devenir l’un des pères de la microscopie? Et bien je suppose qu’il devait être très pointilleux, ou exigeant ou curieux ou malin, ou tout cela à la fois. En tout cas, il voulait un instrument qui l’aiderait à compter le nombre de fils dans les tissus. Apparemment, au début il a utilisé des éclats de diamants et puis il s’est mis à polir des morceaux de verre. Et il le fit très bien, car non seulement son commerce fut florissant mais il étendit l’usage de ses lentilles à d’autres applications, comme nous allons le voir. Ainsi, le polissage des lentilles devint un hobby, puis la technique se raffina et le tout produit l’un des objets scientifiques le plus utilisé de tous les temps. Ainsi donc, notre homme était très curieux et il s’est mis à regarder tout et n’importe quoi avec son microscope. Car il avait trouvé un moyen de monter une toute petite lentille, environ de la taille d’une tête d’aiguille sur un support en laiton, percé d’un trou pour faire passer de la lumière. L’échantillon était placé sur une pointe métallique, solidaire du support et que l’on déplaçait face à la lentille pour en explorer le contenu. L’ensemble était tenu très près de l’œil, face à la lumière (figure 6). Et voilà notre microscope. Et il se trouve que c’était un excellent microscope parce que le fait d’utiliser une seule toute petite lentille (pour les savants qui nous écoutent, avec une distance focale très petite qui limite les aberrations chromatiques) d’excellente qualité (il avait vraiment peaufiné sa technique de polissage), fait qu’il pouvait grossir les objets 300 fois. Le microscope que Leeuwenhoek utilise permet une résolution de 1,4 micromètres (soit 300 X). Soit 1/35e de la largeur d’un cheveu!

C’est en fait très honorable par rapport aux microscopes actuels qui possèdent un pouvoir grossissant de 1000x.

Rappelons que notre homme n’est pas la figure typique du scientifique, d’ailleurs on lui reproche parfois une démarche peu rigoureuse. Mais néanmoins, on lui connaît au moins 400 lentilles, toutes aussi petites les unes que les autres. Et il était malin, il n’a jamais dévoilé ses secrets, comment il polissait ces petits morceaux de verre, comment il les montait sur le support en laiton du microscope, quelle source de lumière il utilisait… Toujours est–il qu’Anthoni Leeuwenhoek est considéré aujourd’hui comme le père de la microbiologie, c’est à dire l’étude des bactéries.

Et, il est devenu fort célèbre, il a quand même reçu la visite de Pierre le Grand de Russie, ou Frédéric II de Prusse ! Il est un bel exemple d’autodidacte qui montre encore une fois que la curiosité est bien le plus important en science, que l’essentiel comme le disait Einstein est de se poser des questions, pas d’accumuler des connaissances.

Quand la “Royal Society of London” fut capable de reproduire son expérience, il devint immédiatement célèbre et ouvrit la voie aux chercheurs des générations suivantes.

On connaît toute une variété d’échantillons qu’il a observés et décrits : des gouttes de pluie, de la plaque dentaire, des morceaux d’intestin, des moules. C’est comme cela qu’il a découvert les bactéries (appelées ‘animalcules’), qu’il a découvert la parthénogénèse des insectes c’est à dire le fait que certains animaux peuvent se multiplier sans reproduction sexuée. Il a regardé beaucoup de spermatozoïdes aussi (chiens, insectes, humains… Je vous laisse élaborer ici comment et pourquoi).

En parallèle, et pas si loin que cela géographiquement, un autre scientifique développa une variante du microscope optique. Il s’agit de Robert Hooke. Le pouvoir grossissant de son microscope est lié à l’utilisation de plusieurs lentilles convexes (figure 7). Mais comme les lentilles employées à la réalisation de ces microscopes présentaient toutes des défauts d’aberration chromatique entourant les bords de l’image, la plupart des scientifiques rejetèrent le microscope composé et réutilisèrent le microscope à lentille simple, comme celui de Leewenhoek. Ce microscope offrait des grossissements moins importants, mais possédaient une qualité d’image plus nette.

C’est au milieu du XVIIIe siècle que le Britannique John Dollond, corrigea le défaut d’aberration chromatique des microscopes composés en utilisant une lentille de forme différente (Figure 8)

Depuis cette époque, le microscope optique est similaire à ceux que nous connaissons aujourd’hui. A ce jour, bon nombre d’améliorations on contribué à perfectionner cet instrument, tant en matière optique que mécanique. Il est passé d’une puissance de grossissement de 200 à 1500 fois en moyenne. La plupart des observations courantes se font entre 200 et 400 fois la taille nominale de l’objet observé.

Plus de quarante modèles de microscopes optiques sont disponibles sur le marché. Il n’est pas nécessaire d’acquérir un modèle haut de gamme pour réaliser des observations courantes. Un microscope équipé d’une tête monoculaire peut suffire à tout amateur désireux de découvrir le monde de l’infiniment petit.

II- La microscopie électronique

Le microscope optique, même avec des lentilles optiques parfaites et une illumination idéale, ne pourra jamais distinguer des objets plus petits que la moitié d’une longueur d’onde de lumière. Prenons un exemple. La lumière blanche a une longueur d’onde moyenne d’environ 0.55 µm. La moitié de 0.55 c’est environ 0.275. Donc si l’on regarde 2 lignes qui sont plus proches que 0.275 µm, on en verra qu’une. Un point plus petit que 0.275µm peut être discerné comme un petit nuage tout au mieux. Donc, la seule solution pour augmenter la résolution du microscope, c’est d’utiliser une source d’illumination ayant une longueur d’onde plus courte.

Et c’est ainsi qu’est née l’idée du microscope électronique. Au lieu d’utiliser les photons, on utilise des électrons. Les électrons sont ces petits grains de matière, des particules qui sont des constituant de tous les atomes, et qui portent une charge négative. Ce sont eux les constituants de base du courant électrique.

Plus précisément, c’est grâce au développement des tubes cathodiques que le ME a pu être développé.

Heinrich Rudolph Hertz (1857-94) suggéra que les faisceaux d’émission pouvaient être caractérisés par une longueur d’onde.

Heinrich Hertz (figure 9)

C’est vraiment aussi un savant remarquable. Il est connu principalement pour deux contributions majeures en sciences : ses travaux sur les ondes hertziennes, ces ondes radios électromagnétiques, auxquelles il a donné son nom, et sa théorie sur les déformations des matériaux à l’origine du modèle de Hertz utilisé comme point de départ de tous les modèles d’indentation par exemple. Il devait être incroyablement humble parce qu’il pensait que ses découvertes sur les ondes radios n’auraient jamais d’application pratiques. Il est décédé très jeune, à 36 ans, d’une maladie auto-immune relativement rare (granulomatose avec polyangéite).

Emil Wiechert en 1899 , physicien allemand d’origine russe, montra que ces faisceaux pouvaient être focalisés sur un point en utilisant un champ magnétique produit par une bobine (figure 10).

Ce n’est qu’en 1926 que Hans Busch , allemand lui aussi, démontra la théorie qui explique qu’en effet un solénoïde (une bobine donc) peut faire converger un faisceau d’électrons de la même manière qu’une lentille de verre fait converger un faisceau de photons.

Dans le microscope électronique (ME), les électrons sont accélérés sous vide, jusqu’à ce que leur longueur d’onde soit 100 000 fois plus petite que celle de la lumière blanche. Puis le faisceau est focalisé sur un échantillon, et ils sont soit déviés soit absorbés par l’échantillon. Ceux qui sont déviés ou non absorbés sont récoltés sur un système de détection, type caméra CCD, comme les appareils photo numériques (Fig 11).

Figure 11 – Principe du microscope électronique

Le premier prototype fut construit en 1933 par l’ingénieur Ernst Ruska et pouvait détecter des objets de 50 nm. Il était énorme, il fallait une pièce entière pour le faire rentrer.

Le premier EM commercial fut construit en Angleterre au Collège Imperial de Londres, mais en fait sa résolution ne dépassait guère celle d’un bon microscope optique ! Ce qui montre au passage combien il n’est pas aisé de faire la transition entre des appareils mis au point dans des labos de recherche et la production commerciale.

Les premiers EM n’étaient pas trop intéressants pour les microscopistes, parce que le faisceau d’électrons était très chaud et transperçait les échantillons. Mais quelqu’un de bien malin, et je ne sais pas qui, a eu l’idée géniale de recouvrir les échantillons biologiques avec du tétraoxide d’osmium, et de les couper en tranches hyper fines, et cela a marché. Non pas que l’échantillon était moins chaud, mais le tétraoxide d’osmium empêche les lipides de fondre (on dit qu’on les fixe) et l’utilisation de coupes fines permet d’obtenir des images rapidement, sans focaliser le faisceau trop longtemps au même endroit). On a ainsi commencé à obtenir des images intéressantes en biologie. A l’université de Toronto, en 1938, Eli Burton et ses étudiants construisirent le premier EM vraiment à haute résolution. Malheureusement la seconde guerre mondiale a ralenti les progrès suivants, mais 20 ans après la guerre, la résolution de l’EM était déjà de 1nm (rappelons qu’un nm c’est environ 10 atomes, environ 6000 plus petit que le diamètre d’un cheveu).

Les différents types de EM

Plus des électrons se déplacent rapidement, plus leur longueur d’onde est petite. La résolution d’un EM est reliée à cette longueur d’onde : plus elle est courte, plus la résolution augmente. Donc, pour augmenter la résolution on essaie au maximum d’accélérer la vitesse des électrons, en augmentant la ddp appliquée entre les lentilles magnétiques.

Les ME aujourd’hui peuvent atteindre un grandissement des images de 2 millions de fois ! Si l’on pousse la résolution, on peut visualiser des objets de la taille de l’atome, une molécule pour les échantillons biologiques. Toutefois, il existe une grosse limite à cette technique : aucun échantillon biologique ne peut survivre dans le vide poussé qui existe à l’intérieur du microscope. Il existe bien quelques EM commerciaux qui permettent de visualiser des échantillons humides, mais il y a encore beaucoup de limites à la technique.

Revenons un petit peu sur le principe des ME

Dans le ME, les lentilles magnétiques guident les électrons, tout comme dans un microscope optique les lentilles optiques guident les photons. Mais il existe en fait deux types de ME, selon les électrons que l’on détecte.

Le ME à Transmission (MET) ou TEM en anglais (figure 12 et 13)

Lorsque les électrons bombardent l’échantillon, ils peuvent traverser la matière, plus ou moins et plus ou moins vite selon la densité de la matière traversée à cet endroit-là, et être recueillis sous l’échantillon, il s’agit du microscope à transmission , MET. Ainsi, seuls les échantillons très fins, ou découpés en tranches très fines peuvent être étudiés. Les images produites sont en noir en blanc et deux dimensions. Par exemple, à l’intérieur d’une cellule, le noyau et les autres composants cellulaires , les organelles, sont plus denses que la soupe dans laquelle ils baignent. Les objets les plus denses arrêtent plus les électrons que les zones de relative moindre densité.

La résolution du MET permet de voir des atomes de carbones séparés par 0,089 nm ou des atomes de silicium (0,078nm). Ainsi le MET est très utilisé dans le domaine des nanotechnologies, des semi-conducteurs pour la microélectronique. En biologie, c’est la préparation des échantillons qui est le facteur limitant. Les méthodes de préparation pour préserver les structures et accroitre les contrastes sont incroyablement nombreuses, parfois spécifiques à un spécimen seulement et souvent très compliquées (longues avec beaucoup d’étapes).

Le ME à Balayage (figure 12 et 13)

Lorsque les électrons arrivent sur la surface des échantillons, ils peuvent aussi, au moment où ils frappent la surface provoquer l’émission de nouveaux électrons, selon un angle de réflexion, et ce sont ces nouveaux électrons qui sont recueillis et utilisés pour former une image sur le détecteur. Il s’agit du microscope à balayage. Le faisceau d’électrons est balayé à la surface de l’échantillon dans un mouvement de balayage, en zig-zag donc.

La résolution du MEB est environ dix fois moindre que celle du TEM, mais permet d’obtenir une profondeur de champ d’observation qui n’existe pas avec le TEM, une sorte d’image en 3D.

Préparation des échantillons

Je le disais plus haut, les gens qui font de la ME, et qui la font bien, ont une somme de connaissance gigantesque ! Il faut pour le MET pouvoir observer des coupes super fines de tissus, et pour le MEB avoir des surfaces qui réfléchissent les électrons.

Citons brièvement quelques techniques de bases :

-découper les échantillons en fines tranches, 50 à 90 nm, avec un appareil appelé microtome et des lames de rasoir en diamant.

-fixer les échantillons, avec des produits chimiques, pour préserver les structures, les rendre plus dures. On force les molécules à se lier entre elles. En fait, c’est le même effet que faire bouillir un œuf frais ! On se retrouve avec un œuf dur !

-congeler les échantillons à très basse température et les couper en fines tranches. C’est la cryoscopie

-Infiltrer les tissus avec des résines, pour figer les structures et pouvoir les couper ensuite. Il faut auparavant enlever l’eau, le plus souvent par des bains successifs dans de l’alcool

-augmenter les contrastes en recouvrant les surfaces avec des métaux lourds

-Couper les échantillons après les avoir congelés, car la lame suit les contours de moindre fragilité et révèle ainsi des structures selon leur dureté. Souvent il faut aussi recouvrir ensuite pour les observations en TEM par un film de Pt puis C, et c’est le film de C que l’on observe, pas l’échantillon lui-même.

Il existe une quantité incroyable de livres sur le sujet et de quoi occuper la vie de beaucoup de gens à temps plein….

Les limites de la technique

-ce sont des appareils chers et difficiles à maintenir en bon fonctionnement (ddp élevées, vide, sensible aux vibrations…)

– difficile à utiliser, surtout par rapport à un microscope optique.

-la préparation des échantillons est délicate et induit de toute façon des modifications de la structure des échantillons en biologie. Par exemple, congeler les échantillons induit la formation de cristaux de glace qui sont difficiles à éviter et qui détruisent les structures.

Heureusement, les limites du microscope électronique, notamment dans la préparation des échantillons sont maintenant et depuis peu, un peu compensés par l’essor d’un troisième type de microscopie, très différente des deux précédentes, donc complémentaire dans son utilisation.

III La microscopie à champ proche.

L’idée de départ date des années 1930, on trouve des publications ingénieuses qui montrent combien les hommes sont créateurs, car si l’idée était bonne, elle n’était pas réalisable d’un point de vue technique. Les limitations de la technologie ne permettaient pas à l’époque de construire de tels instruments.

Et c’est en 1981, que le premier appareil a vu le jour chez IBM Zurich. 2 physiciens (Gerd Binnig et Heinrich Rohrer ) ont annoncé la naissance de leur nouveau jouet : le microscope à effet tunnel, ou STM, pour Scanning Tunneling Microscope. Un nom bien mystérieux, comme tout ceux d’ailleurs de la famille des microscopes à champ proche. Cette fois on utilise encore les électrons, mais sans considérer les particules ; on utilise le courant électrique, c’est à dire le transfert de charges électriques. L’effet tunnel était déjà bien connu, qui indique que si on applique une différence de potentiel sur un échantillon conducteur, comme un métal, et qu’on approche très très près une fine pointe métallique conductrice, mais qu’on ne touche pas la surface, un courant électrique va s’établir entre la surface et la pointe. (figure 14). Le fait que l’intensité du courant dépende de la distance entre la pointe et l’échantillon permet de mesurer cette distance. En balayant la pointe sur la surface de l’échantillon, selon la topographie de la surface le courant est plus ou moins fort et on peut ainsi établir une carte topographique de l’échantillon. Je simplifie beaucoup évidemment, mais c’est le principe !

Il aura fallu attendre environ 50 ans avant de mettre en pratique cette idée, parce que ce n’est pas facile de fabriquer des pointes très fines, 1000 fois plus fines qu’un cheveu. Pas facile aussi d’isoler l’appareil de toutes les vibrations. Imaginez que même parler devant l’appareil induit des vibrations acoustiques ou des changements de température, qui changent la distance entre la pointe et la surface, et perturbent donc les mesures. Enfin fabriquer un contrôleur électronique qui puisse mesurer des courants de l’ordre du nano-ampère et très vite (avec une vitesse de quelques MHz, c’est à dire 1 million de mesures par seconde), n’était pas possible en 1930. Aujourd’hui le STM fonctionne très bien, et a permis de reculer les limites de la résolution, il a permis de visualiser des atomes en routine, sans modifier les surfaces, sans préparation de ces échantillons et il est encore utilisé.

Toutefois, il existe une limite importante inhérente à cette technologie : les échantillons doivent être conducteurs. Donc beaucoup d’échantillons ne pouvaient pas, du

moins facilement, être observés avec le STM, dont les échantillons biologiques. Alors nos savants suisses n’en sont pas restés là. Ils ont utilisé le même type de technologie, mais ont remplacé le current tunnel par la détection de forces atomiques. Ainsi est né l’AFM, pour Atomic Force Microscope, en 1986, par Gerd Binnig, Christoph Gerber, et Calvin Quate. Le principe, c’est comme nos vieux lecteurs de disques vinyl (oui, je sais que beaucoup ici n’ont jamais vu un disque vinyl !) Bref, notre très fine aiguille est maintenant attachée à un bras de levier très très flexible. Quand on balaye cette aiguille au dessus de la surface d’un échantillon, comme une cellule vivante, parce qu’il existe des forces d’interaction entre cette pointe et la surface, le levier se courbe plus ou moins (figure 15). Là aussi, les forces dépendent de la distance entre la pointe et la surface. Donc le microscope mesure cette flexion et l’utilise dans un système de boucle de rétro-contrôle pour garder la pointe toujours à la même distance de la surface. Donc, on balaye la pointe, et en même temps on bouge la pointe verticalement pour suivre les contours de la surface. Si il y a une bosse, la flexion est trop importante il faut éloigner la pointe. Si il y a un trou, il n’y a pas assez de flexion, il faut approcher la pointe. C’est simple comme principe ! Ainsi on peut reconstruire la surface en 3 dimensions.

Et ça marche très bien, et en milieu liquide de surcroît, ce qui est très attrayant pour les biologistes. Les échantillons non seulement ne sont pas beaucoup modifiés quand ils sont préparés, mais en plus la technique AFM en soi est non destructive ; on peut observer les mêmes échantillons plusieurs fois (par opposition aux MET et MEB qui détruisent les échantillons avec les rayonnement d’électrons). On peut ainsi regarder des cellules vivantes sans les détruire, on peut regarder en temps réel comment des fibres de collagène se forment.

On obtient une résolution atomique sur les échantillons durs, comme le mica ou le graphite. En biologie, c’est de l’ordre de la molécule, quelques nm donc. Exemple de la Bactériorhodopsine, (figure 16). La Bactériorhodopsine est une protéine, le principal constituant de la membrane de certaines bactéries. C’est une molécule intéressante à de nombreux points de vue. D’abord son rôle : c’est une pompe, qui transfère des protons (des ions hydrogènes donc) à travers les membranes. D’un point de vue structurel : c’est une longue molécule, qui se replie et qui traverse 7 fois la membrane. Les molécules s’agencent ensuite en trimères (ie 3 molécules qui forment un triangle) dans les membranes. Pour pomper les protons, elle absorbe de la lumière, des photons donc, et plus spécifiquement de la lumière verte. Cela induit un changement de structure qui permet de transférer les protons. Elle ré-émet le photon avec une belle couleur violette. Avec un AFM, on peut voir très bien la structure de la la Bactériorhodopsine, les trimères en particulier et même changer les conditions d’observation (lumière, pH du milieu, force) et voir la protéine changer de forme, c’est superbe. Je salue au passage mes collègues suisses pionniers dans ces travaux : Daniel Mueller et Simon Scheuring.

En plus, on peut utiliser le levier pour pousser sur des surfaces et mesurer leur rigidité, ou pour étirer des molécules et mesurer les forces à l’intérieur de ces molécules qui leur donnent leur géométrie (les liaisons hydrogènes donc). Un exemple bien connu, celui de la Titine. Celle-ci est la protéine la plus longue dans notre corps (>1 µm). Elle se trouve dans les muscles, (protéine la plus abondante dans les muscles) et est responsable notamment de l’élasticité passive de nos muscles, comme un ressort. C’est donc une longue molécule, qui comporte des portions repliées sur elles-mêmes, comme des nœuds (ce qu’on appelle des domaines globulaires), et ces nœuds gardent leur forme à l’aide de liaisons qui relient les brins entre eux (les liaisons hydrogènes, entre un atome d’hydrogène et un autre atome, souvent de l’oxygène) (figure 17). Avec la pointe de notre AFM, on peut aller attraper l’extrémité d’une molécule de Titine, l’étirer, ouvrir un à un ces nœuds, ces domaines globulaires, et mesurer les forces nécessaires, et obtenir des informations sur la géométrie de cette protéine (figure 18).

Un autre exemple fascinant, celui de l’ADN. En 1953 deux chercheurs anglais, James Watson biologiste américain) et Francis Crick (biologiste et physicien anglais), avec des données notamment de Rosalin Franklin et de Jerry Donohue établissent enfin la structure de la molécule d’ADN, en Angleterre. C’est fantastique et ils ont bien mérité leur prix Nobel de médecine en 1962, mais ce qui est aussi fantastique c’est qu’ils n’ont pas utilisé de microscopie, ce sont des preuves indirectes (notamment la cristallographie à rayon X) qui leur ont permis de comprendre ce à quoi cette molécule ressemble, c’est à dire deux long brins enroulés sur eux-mêmes et qui forment une double hélice. Mais c’est avec un AFM que l’on a pu pour la première fois vraiment voir cette double hélice, on a maintenant des images, avec des détails sur la double hélice et toutes ses variations (figure 19).

On peut aussi utiliser des leviers qui conduisent le courant, pour mesurer les propriétés électriques des surfaces, ou des leviers recouverts de matériaux magnétiques pour détecter les champs magnétiques (lire les boîtes noires des avions par exemple !).

Par comparaison avec la microscopie électronique : résolution un peu meilleure, images en 3 D, pas de préparation des échantillons, études mécaniques des échantillons, fonctionnement en milieu liquide, pas de destruction des échantillon, petits instruments, qui sont super robustes.

Comparaison avec la microscopie optique : meilleure résolution mais plus difficiles à utiliser, plus cher

Fait notoire, en 1986 Gerd Binnig et Heinrich Rohrer ont obtenu le prix Nobel de physique pour le STM, en même temps que Ernst Ruska, pour l’invention du EM en 1931 !

Encore beaucoup de route devant soi, ce type de microscopie n’a que 30 ans !

Conclusions :

Il existe un type de microscopie que j’ai omis : le microscope acoustique, qui date d’environ 1949, parce qu’il est plutôt restreint d’utilisation (pour l’étude des matériaux), même s’il présente l’avantage énorme de détecter des structures à l’intérieur des objets étudiés. Comme son nom l’indique il utilise des ondes mécaniques cette fois, mais sa résolution est seulement de l ‘ordre du µm.

Il existe beaucoup de variantes à la microscopie optique, par exemple la microscopie confocale, la fluorescence, mais les principes de base sont les mêmes.

L’AFM a encore beaucoup progrès à faire, mais est de plus en plus utilisée.

Ces deux techniques restent complémentaires de la ME, qui, quant à elle, reste une technique lourde et très chère. Juste pour le fun, sur la figure 20, j’ai copié des images prises par un EM d’une patte de mouche et un dessin par Robert Hooke, selon ses observations avec son microscope optique.

Merci pour votre attention !

Références

http://en.wikipedia.org/wiki/Antonie_van_Leeuwenhoek

http://micromonde.free.fr/histoire/#

http://www.optics1.com/optics_history.php

http://h2g2.com/approved_entry/A666128

Encyclopedia Britannica.

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