理化学研究所(理研)生命機能科学研究センター集積バイオデバイス研究チームと合成生物学研究チームは、マイクロ流体デバイスを利用した生物組織切片の長期間の灌流培養に成功した。

灌流培養とは、培養条件を長期間一定に保つために培養液を連続的に交換する手法。従来の灌流培養では培養液の消費量が多く、高価なものを用いた実験が現実的でないことに加え、培養液の交換に時間がかかるため、細かい時間単位での観察が難しかった。

今回研究チームでは、半導体製造技術を用いて液体などに含まれる微粒子を操作する装置「マイクロ流体デバイス」を作製。脳の視床下部にある哺乳類の概日時計(約24時間周期の体内時計)を司る視交叉上核(しこうさじょうかく、SCN)の長期培養を行なった。

新たに製作されたマイクロ流体デバイスは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)と培養液透過膜を組み合わせて構成される。ガラス基板上に培養液の流路パターンを転写したチップ(PDMS流路チップ)を貼り合わせ、チップの上にSNC切片を静置する培養液透過膜を設置する。

培養液透過膜にも流路パターンに沿ってPDMSを塗布し硬化させる。透過膜は親水性のポリテトラフロロエチレンでできており、培養液はPDMSに浸透しないため、PDMSが塗布されていない部分の透過膜のみに流れるようになる。このデバイスを37℃を維持する定温培養器に静置し、顕微鏡を使って切片を観察する。

培養液の灌流は流路の出入り口につないだポンプで制御。水を灌流させる実験を行なった結果、供給が2μL/分、除去が2.5μ/Lが適量であることが分かった。除去の方が多いのは、透過膜越しに空気が流入するためだという。

このように作製されたマイクロ流体デバイスの有効性を確認するため、従来の静置培養と比較した。概日時計遺伝子の1つであるPer2をルシフェラーゼ遺伝子と融合させた遺伝子改変マウスから、0.3mm厚のSCN切片を採集。2つの手法で培養を行ない、概日時計に従った化学発光を観察した。

どちらの手法を用いた場合でもほぼ24時間周期の発光強度の変化が確認できたが、静置培養法では発光強度の低下が早かった。一方でPDMSを用いたマイクロ流体デバイス上で培養した場合はほとんど低下が見られなかった。発光強度の半減期で差をとった場合、マイクロ流体デバイスでは約20倍の延長が可能になったこととなり、灌流開始から25日後でも感度よく継続が行なえた。

培養液を灌流することで、組織が生存するために必要な栄養が供給されただけでなく、老廃物の除去が行なわれ、呼吸も確保できたことで、長期培養に成功したと考えられる。

今回のPDMSを用いたマイクロ流体デバイスの有効性により、従来と比べて少量の培養液で簡単に組織培養や観察が可能になる。ポンプの流量を調整すればSCN以外の組織への応用も可能だという。

また、複数の組織を1つのデバイス上で並行して培養して観察したり、長期間の培養が行なえるため、発生生物学や生物組織工学への応用が期待されている。