ポイント

古い記憶同士が結びつき異なる新たな記憶が形成されるメカニズムは不明だった。

脳にある２つの古い記憶を人為的に活動させて、新しい記憶を作り出せることを示した。

さまざまな記憶情報を関連づけ、新たな意味を持つ記憶を形成するという高次の脳機能の解明につながることが期待できる。

ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業において、富山大学 大学院医学薬学研究部（医学）生化学講座の井ノ口 馨 教授らは、マウスを使い、脳に蓄えられている異なる２つの記憶を持つ細胞集団を人為的に活動させて、新たな記憶を作り出すことに成功しました。 「犬のように足が四本で動く生き物は動物」、「カラスのように羽があり空を飛ぶ生き物も動物」といった記憶が関連づけられて、「動物とはこういったものだ」という記憶（知識）が形成されてきます。このように複数の記憶が連合注１）することで新しい意味を持った記憶が形成されますが、そのメカニズムは不明でした。近年、光遺伝学注２）の手法を用いて、特定の記憶を人為的に想起させたり、その記憶を現在経験中の出来事に連合させて偽記憶を作り出したりすることができるようになってきました。ところが、すでに記憶として蓄えられている独立した複数の記憶を人工的な手法で連合させることができるのかは不明でした。 本研究グループはマウスを用い、場所の経験と恐怖体験をそれぞれ独立した記憶として覚え込ませたあとに、脳内にあるそれぞれの記憶痕跡注３）を光遺伝学的手法で人為的に同期活動させることで、これらの独立した記憶を連合させることができることを示しました。 私たちは脳に蓄えられているさまざまな記憶情報を関連づけていくことで、一つ一つの記憶から知識や概念を形成していきます。記憶が連合するメカニズムに関する今回の研究成果は、こうしたヒトの高次脳機能の解明につながる成果です。 本研究は、富山大学 大学院医学薬学研究部（医学）の大川 宜昭 助教、東京慈恵会医科大学の加藤 総夫 教授らと共同で行ったものです。 本研究成果は、２０１５年４月２日（米国東部時間）に米国科学誌「Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ」のオンライン速報版で公開されます。

本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。 戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ） 研究領域 「生命動態の理解と制御のための基盤技術の創出」

（研究総括：山本 雅 沖縄科学技術大学院大学 教授） 研究課題名 「細胞集団の活動動態解析と回路モデルに基づいた記憶統合プロセスの解明」 研究代表者 井ノ口 馨（富山大学 大学院医学薬学研究部（医学） 教授） 研究期間 平成２５年１０月～平成３１年３月 上記研究課題では、記憶のダイナミックな側面に注目し、ニューロン集団の活動動態に焦点を当てた解析と数理モデルの構築を通して、神経回路レベルの記憶のメカニズム解明を目指します。

＜研究の背景と経緯＞

脳が持つダイナミックで柔軟な性質の１つに、異なる記憶同士を連合して新たな意味を持つ記憶を形成する記憶アップデートの能力があります。

記憶は脳の中の特定の神経細胞集団という形で符号化されて蓄えられています。経験時に活動した特定の神経細胞集団（セルアセンブリと呼びます）として記憶は符号化され、そのセルアセンブリが再び活動するとその記憶が想起されます（図１）。異なる記憶には異なるセルアセンブリが対応します。近年、光遺伝学を用いて、特定の記憶に対応するセルアセンブリを人為的に活動させてその記憶を強制的に想起させたときに恐怖体験を与えると、その記憶と恐怖が結びつき偽記憶が形成されることが示されました。すなわち、過去の記憶と体験中の出来事を連合させることで現状を誤認させることができるようになってきました。

ところが、すでに記憶として蓄えられている古い記憶同士が連合して質的に異なる新たな記憶が形成されるメカニズムは不明でした。そのため、２つの記憶を人工的な手法で連合させ、新たな記憶を構築・再現することができるのかが大きな課題として残っていました。

＜研究の内容＞

本研究ではマウスを用い、学習課題として文脈性恐怖条件付け注４）の変法であるＣＰＦＥ課題注５）を使用しました。条件付け装置（四角い箱）に入れられてすぐ電気ショックを受け直ちに取り出される（即時ショック）と、マウスは装置と恐怖体験を関連づけることができません。ところが、いったん装置に入れてその場所の記憶を形成させておくと（文脈事前暴露）、そのあとの即時電気ショック体験で装置と恐怖を連合して記憶し、四角い箱で高い恐怖反応を示します（図２、ペア群）。一方、文脈事前暴露として丸い箱を覚え込ませた後に、四角い箱で即時ショックを与えたケースでは、両者の体験間に連合は起きないため、丸い箱に入れられたマウスは低い恐怖反応しか示しません（図２、アン・ペア群）。丸い箱の体験と恐怖の体験（電気ショック）は独立した記憶として覚え込まれていました。

文脈事前暴露と即時ショックの体験時に活動した神経細胞をＣａｔＦＩＳＨ法注６）で解析したところ、場所の記憶と恐怖の記憶が連合する場合は、文脈事前暴露時と即時電気ショック時のどちらでも活動する神経細胞（オーバーラップ神経細胞）の数が、特に扁桃体のＢＬＡ部位で増加しました（図２）。すなわち、場所セルアセンブリと恐怖セルアセンブリの間のオーバーラップ率が連合しない場合に比べて大きく増大することが分かりました。このことより、２つのセルアセンブリが同時に活動し重なることが、記憶の連合のメカニズムであることが強く示唆されました。

次に、２つの独立した記憶を人為的に連合できるか否かを調べました。ｃ－ｆｏｓ：：ｔＴＡ遺伝子改変マウス注７）と組み換えレンチウイルス遺伝子導入法注８）を組み合わせたシステムを用いて、丸い箱と即時ショック時（アン・ペア群）に活動した海馬と扁桃体のセルアセンブリにチャネルロドプシン２を導入しました（図３）。これらの体験の１日後にマウスがホームケージでくつろいでいるときに、海馬と扁桃体に刺入した光ファイバーを通じて２０Ｈｚのレーザー光を２分間照射し、チャネルロドプシン発現細胞を活動させました。この操作で丸い箱のセルアセンブリと恐怖体験のセルアセンブリが同期活動します。その翌日、これらのマウスを丸い箱に入れると、強い恐怖反応を示しました。マウスが体験したことのない三角の箱では恐怖反応を示さなかったことから、場所の記憶と恐怖記憶の人為的な連合には特異性があることが分かりました（図４）。この人為的な記憶の連合には、ＮＭＤＡ受容体注９）依存性やたんぱく質合成依存性注１０）があり、さらには時間経過とともに般化注１１）の過程を経るなど、通常の方法で形成される連合記憶と同じ性質を持つことが分かりました。

以上の結果から、それぞれの記憶に対応するセルアセンブリが同時に活動しオーバーラップすることが記憶の連合のメカニズムであること、また、異なるそれぞれのセルアセンブリを同期活動させることで独立した２つの記憶を人為的に連合させることができることが明らかになりました。

＜今後の展開＞

鳥と翼と空を飛ぶことは独立した情報ですが、後に関連づけて翼で空を飛ぶことが鳥の定義となります。このようにもともと結びついていない過去の記憶同士を何らかのきっかけで関連づけて体系立ったものに進化させていくのはヒトの脳機能にとって非常に重要なことです。私たちはすでに脳に蓄えられているさまざまな記憶情報を関連づけていくことで、一つ一つの記憶から知識や概念を形成していきます。記憶が連合するメカニズムに関する今回の研究は、こうしたヒトの高次脳機能の解明につながる成果です。また、関連性の弱い記憶同士の不必要な結びつきは、さまざまな精神疾患に関わっていることから、独立した２つの記憶の連合に関する今回の成果は精神疾患の治療法創出につながる可能性があります。

＜参考図＞

図１ 脳と記憶痕跡の概要 記憶がセルアセンブリとして符号化されて脳内に蓄えられる様子を示す。丸：神経細胞、緑色：学習時に活動した神経細胞、稲妻：活動中であることをあらわす。緑の神経細胞が同時に活動すると、学習時に形成された記憶が想起される。海馬ＣＡ１領域はエピソードや場所の情報、扁桃体ＢＬＡ領域は恐怖情報を司る脳部位。

図２ ＣＰＦＥ課題の概略とＣａｔＦＩＳＨ解析 文脈事前暴露と電気ショック時に違う箱を使用したアン・ペア群では、記憶テスト時に低い恐怖反応（フリージング反応）しか示さないのに対して、同じ箱を使用したペア群では高い恐怖反応を示した。ペア群では、海馬ＣＡ１領域と扁桃体ＢＬＡ領域でともにオーバーラップ神経細胞（黄）の数が増加した。 緑：文脈事前暴露の時に活動した神経細胞、赤：即時電気ショックの時に活動した神経細胞、黄：どちらのケースでも活動した神経細胞（オーバーラップ神経細胞）。

図３ 学習時に活動した神経細胞特異的にチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）を導入する原理 ｃ－ｆｏｓ：：ｔＴＡ遺伝子改変マウスでは、活動した神経細胞特異的にｔＴＡ転写因子が発現誘導される。組み換えレンチウイルスにより、実験群としてＴＲＥ：：ＣｈＲ２－ＥＹＦＰやコントロール群としてＴＲＥ：：ＥＹＦＰを海馬および扁桃体ＢＬＡの神経細胞に導入しておく。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）非存在下（ＯＦＦ ＤＯＸ）で、ｔＴＡ転写因子はＴＲＥ配列に結合してＣｈＲ２－ＥＹＦＰやＥＹＦＰの発現を誘導する。

図４ ２つの独立した記憶の人為的な連合 扁桃体ＢＬＡと海馬ＣＡ１にＣｈＲ２－ＥＹＦＰあるいはＥＹＦＰが導入されたｃ－ｆｏｓ：：ｔＴＡ遺伝子改変マウスにアン・ペアのＣＰＦＥ課題を与えた。その学習時にＯＦＦ ＤＯＸとして、活動した神経細胞（緑、赤、黄色）のみをＣｈＲ２－ＥＹＦＰあるいはＥＹＦＰで標識した。翌日マウスがホームケージでくつろいでいるときに、レーザー照射でそれらの神経細胞群を同期活動させた。記憶テストでは、ＣｈＲ２－ＥＹＦＰが導入され、ＣＡ１とＢＬＡ共にレーザー照射を受け、かつテストで丸い箱に入れられたマウスだけが高い恐怖反応を示した（赤い四角で囲んだ紫のバー）。

＜用語解説＞

注１） 連合 複数の異なる経験や記憶を関連づけることを指す。関連づけられたあとは、片方の記憶の想起が他方の記憶の想起を引き起こす。「ベルの音」と「エサ」が関連づけられ、ベルを聞くとよだれを流すパブロフの犬は連合のシンプルな例である。 注２） 光遺伝学 遺伝子導入によって特定の波長の光をあてると活性が変化する分子を発現させることで、狙った細胞の機能を光で制御する方法。代表的な分子がチャネルロドプシン２（Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ２，ＣｈＲ２）で、非選択的陽イオンチャンネルを構成する。神経細胞にＣｈＲ２を発現させると、神経活動時の細胞膜の脱分極を光によるイオン流入で再現できるため、光照射で人為的に標的細胞の神経活動を誘導できる。 注３） 記憶痕跡 記憶は、学習時に活動した特定の神経細胞集団（セルアセンブリ）という形で脳内に残った物理的な痕跡として保存されることが近年明らかとなった。この細胞集団が、記憶痕跡である。学習時に同期活動をした神経細胞同士は強い連絡で結ばれるため、何らかのきっかけで一部の神経細胞が活動すると、このセルアセンブリ全体が活動し、その結果として記憶が想起される。 注４） 文脈性恐怖条件付け 恐怖条件付け学習では、動物を突発的に驚かせる無条件刺激（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｓｔｉｍｕｌｕｓ：ＵＳ）と、無条件刺激時の条件・状況を動物に把握させるための条件刺激（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｓｔｉｍｕｌｕｓ：ＣＳ）を同時に提示することで、ＣＳとＵＳが関連した連合記憶が成立する。文脈性恐怖条件付けでは、電線グリッドのある箱に入れられた状況や箱という空間を含む情報（文脈）がＣＳ、電気ショックがＵＳとして使用され、これらが連合し恐怖記憶を形成する。このように条件付けされたマウスやラットは、再度同じ文脈にさらされると再度電気ショックが来ることを恐れ身動きしなくなる“フリージング反応（すくみ行動）”を示すことから、テスト時のこのフリージングの割合を定量化したものが記憶の評価の指標となる。 注５） ＣＰＦＥ課題 Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ Ｐｒｅ－ｅｘｐｏｓｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ課題の略。通常の文脈性恐怖条件付け学習では、文脈に十分にさらした後電気ショックを与えることで文脈とショックの連合学習が成立するが、文脈にさらした直後にショックを与える（即時ショック、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｓｈｏｃｋ）では、学習が成立しない。しかし、即時ショックの前に同じ文脈に十分さらしておく（Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ Ｐｒｅ－ｅｘｐｏｓｕｒｅ）と、即時ショック時に過去に経験した文脈の情報が手助けとなり連合学習が成立する。この際、事前にさらす文脈と、即時ショックを与える文脈が異なる場合（アン・ペア群）では連合学習は成立しない。 注６） ＣａｔＦＩＳＨ法 Ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の略。蛍光を利用しｍＲＮＡの局在を調べるＦＩＳＨ法を利用して、神経細胞の活性化したタイミングを同定する技術。神経活動で発現誘導するａｒｃ ｍＲＮＡは、神経活動５～１０分後までは細胞の核内に留まるが、約３０分後には細胞質に局在する。これを利用し、３０分間隔で２回のイベントを行った直後の脳サンプルで調べた場合、細胞質ａｒｃシグナルを持つ細胞は最初のイベント時に、核内ａｒｃシグナルを持つ細胞は、２回目のイベント時に、両方のシグナルを持つる細胞は２回のイベント両方で活性化したと確認できる。 注７） ｃ－ｆｏｓ：：ｔＴＡ遺伝子改変マウス 神経活動を生じた神経細胞内に転写因子ｔＴＡを発現する遺伝子改変マウス。ｃ－ｆｏｓ遺伝子は、神経活動によって発現誘導されるが、この遺伝子発現に必要なプロモーター配列の後ろにｔＴＡ遺伝子配列をつないだ遺伝子を持つ。ｔＴＡはドキシサイクリン（Ｄｏｘ）非存在下でのみ標的配列であるＴＲＥ配列に結合しその下流の遺伝子の発現を誘導することができる。このことから、このマウスを使うと神経活動した細胞にＴＲＥ配列の下流につないだ蛍光たんぱく質やチャネルロドプシン２の遺伝子を発現させることで観察・活性制御することができる。 注８） 組み換えレンチウイルス遺伝子導入法 ヒト免疫不全ウイルスを基に作られたウイルスベクターで、遺伝子改変に利用されている。好みの遺伝子配列を容易にウイルスゲノムに組み込むことができ、結果としてウイルスが感染した細胞のゲノムに、好みの遺伝子配列を組み込むことができる。いくつかの構成たんぱく質をコードした遺伝子を欠失しているため、感染した細胞内で増殖することがなく毒性が低い。 注９） ＮＭＤＡ受容体 Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅの略。神経細胞同士は、シナプスで連絡をして情報をやりとりしている。主なシナプス連絡の１つは、シナプスの前にある活動した細胞がグルタミン酸を放出し、後ろの細胞が受容体でそれを受け取ることで行われる。グルタミン酸受容体の１種のＮＭＤＡ受容体は、イオンチャンネル型の受容体で、グルタミン酸を受容している時に神経細胞が活動して脱分極するとカルシウムイオンを含む陽イオンを通すことができるようになる。この、ＮＭＤＡ受容体の機能が引き金の１つとなり、記憶形成のための学習時の細胞内機構がオンになる。ＮＭＤＡ受容体を持たないマウスでは、ある種の長期記憶形成ができない。本論文で用いている生理的条件下のＣＰＦＥ課題のペア群では、場所の情報と即時ショックの情報が連合するが、ＮＭＤＡ受容体の機能を阻害するとこれら２つの記憶の連合ができなくなる（ＮＭＤＡ受容体依存的）。 注１０） たんぱく質合成依存性 生理的な条件下で２つの記憶が連合するＣＰＦＥ課題のペア群で、脳内のたんぱく質合成を阻害しておくと連合ができなくなる。このことから、２つの記憶の連合はたんぱく質合成依存的であるという。 注１１） 記憶の般化 般化とは、特有の刺激に反応するようになった状態で、類似の刺激にも同じように反応するようになること。文脈性恐怖記憶は、学習直後、学習時のＣＳの文脈（特有の箱）で特異的に想起される。しかし、学習後時間を経た記憶（遠隔記憶と呼ばれる）は、この特異性が失われ、学習時のＣＳ文脈以外の空間（違う箱）でも恐怖反応を示すようになる。これが、記憶の般化である。

＜論文タイトル＞

“Artificial Association of Pre-stored Information to Generate a Qualitatively New Memory”

（既存の記憶の人為的な連合による質的に新しい記憶の創出）

doi: 10.1016/j.celrep.2015.03.017

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井ノ口 馨（イノクチ カオル）

富山大学 大学院医学薬学研究部（医学） 教授

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川口 哲（カワグチ テツ）

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